- oncosystem_new

Go to content

Main menu:

ТЕХНОЛОГИИ > Микро-РНК
ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРО-РНК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
Методы выделения микроРНК из биологического материала основаны на тех же принципах, что и традиционные протоколы изоляции РНК. Так, классический метод выделения нуклеиновых кислот из многокомпонентных биологических образцов включает в себя процедуру лизиса с помощью хаотропных агентов или детергентов. Хаотропными веществами являются соединения, которые нарушают нековалентные взаимодействия (водородные связи, диполь-дипольные взаимодействий, гидрофобные взаимодействия) и, соответственно, изменяют третичную структуру клеточных макромолекул. Детергенты – это органические соединения, состоящие из гидрофобного углеводородного фрагмента и гидрофильной заряженной головной группы, т.н. поверхностно-активные вещества. В определенных условиях они вызывают необратимую денатурацию белков и разрушение био-липидных мембран. Иногда эффективность лизиса может быть повышена с помощью ферментов. Методы выделения РНК, «освобожденной» от белковых связей, традиционно делятся на жидкофазные и твердофазные. Согласно традиционной (жидкофазной) методике, после лизиса биологические образцы смешивают с органическим растворителем. При этом нуклеиновые кислоты переходят в водную фазу, а денатурированные белки – в органическую. Из водной фазы РНК может быть преципитирована этанолом. В твердофазные методы выделения нуклеиновых кислот основаны на их адсорбции к поверхности твердофазных систем на основе кварца, стекла, силикона, соединений железа, других веществ или их соединений. Например, нуклеиновые кислоты обратимо связываются со стеклом в присутствии хаотропных солей высокой концентрации, при этом денатурированные протеины остаются в растворе. После отмывания этанолом, нуклеиновая кислота может быть «снята» со стекла буфером с низкой ионной силой. Рядом очевидных преимуществ обладает использование магнитных твердых носителей. Это упрощает процедуру и даже позволяет ее роботизацию. При выделение из биологических образцов микроРНК имеет значение ряд аспектов.
Во-первых, известно, что микроРНК функционирует в составе многомoлекулярного комплекса RISC (RNA-induced silencing complex). Высокая аффинность взаимодействия молекулы микроРНК с основными компонентами этого комплекса, белками семейства Argonaute (Ago1 или Ago2) была показана в ряде экспериментальных работ (Lima et al., 2009; Tan et al., 2009). Это взаимодействие сохраняется, вероятно, и после выхода микроРНК из клеток в составе везикул или апоптотических телец, поэтому внеклеточная микроРНК выделяется в составе РНК-белковых комплексов (Riley et al., 2012). Связь с белковыми компонентами RISC может осложнить процесс выделения микроРНК. Метод эффективной изоляции микроРНК из белковых комплексов в присутствии каприловой кислоты и гуанидин тиоционата был недавно предложен группой новосибирских исследователей под руководством П.П. Лактионова (Lekchnov et al., 2016). Путем титрования, авторы определили оптимальное соотношение концентраций реагентов при различных значениях pH, и оценили эффективность выделения микроРНК из плазмы и мочи путем ОТ-ПЦР анализа двух молекул (miR-16, miR-126). Интересно, что оптимальные условия выделения микроРНК из плазмы и из мочи существенно отличались.
Во-вторых, размер микроРНК может определять особенности взаимодействия микроРНК с твердофазными носителями: в процессе отмывок эти молекулы могут «смываться» легче, чем другие классы РНК. Этот феномен трудно предсказать и поэтому использование любого твердофазного носителя в процессе изоляции микроРНК требует экспериментальной оптимизации. Вариант решения этой проблемы был предложен компанией Beckman Coulter и реализован в наборе для микроРНК изоляции «Solid Phase Reverse Immobilization (SPRI) magnetic bead». Принцип метода заключается в последовательном удалении из раствора РНК молекул с большой, затем средней молекулярной массой и постепенном обогащении смеси короткими молекулами, т.е. микроРНК. На заключительном этапе используются условия, обеспечивающие максимальное связывание коротких молекул магнитными частицами.
Изоляция микроРНК из биологических образцов остается нетривиальной задачей. Так как качество микроРНК определяет результаты любых методов последующего анализа, выбор и оптимизация метода выделения имеет критическое значение в рамках любыч научных проектов и, тем более, в процессе возможного клинического применения.
 
Back to content | Back to main menu