- oncosystem_new

Go to content

Main menu:

ТЕХНОЛОГИИ > Микровезикулы
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ (ВМВ)
Выделение нановезикул (экзосом) из биологических жидкостей является нетривиальной задачей, и до сих пор в лабораторной практике нет однозначно правильной и всегда приемлемой технологии. В основе существующих методов лежат особенности физической структуры или биохимической композиции мембранных везикул. Но проблема заключается в том, что для ВМВ  характерно уникальное сочетание этих признаков, в то время как одно отдельно взятое качество не может быть критерием отбора. Так, например, размер экзосом сопоставим с размером вирусных частиц, а одни и те же поверхностные белки могут присутствовать на поверхности клеток, фрагментов клеточных мембран или мембранных везикул. Поэтому каждая из существующих технологий имеет определенные плюсы и минусы, а выбор оптимального метода определяется задачами исследования. В целом, чем более «чистую» фракцию экзосом нужно выделить, тем на меньший выход продукта стоит рассчитывать.
Классическим способом выделения экзосом из биологических жидкостей или  культуральных сред является дифференциальное центрифугирование, которое предполагает поэтапное удаление клеточных элементов, клеточного детрита, крупных везикул и финальное осаждение оставшихся нановезикул с помощью ультрацентрифугирования при значениях G (ускорение) > 120.000 - 140.000. Технология может быть оптимизирована дополнительной процедурой – фильтрацией, что позволяет «убрать» крупные везикулы или фрагменты клеточных мембран. Полученный после ультрацентрифугирования осадок может содержать белки, белковые комплексы, мембранные образования с весом меньшим или сопоставимым с весом экзосом. Такой комплексный осадок можно фракционировать путем центрифугирования  в растущем от 15 до 30% градиенте сахарозы, и считается, что фракция в диапазоне плотности 1.13-1.19 г/мл будет представлять собой «чистый» препарат экзосом. Основными недостатками этого метода являются трудоемкость и низкий выход, который объясняется вынужденными потерями на каждом этапе дифференциального центрифугирования.
В дополнение к методам механического разделения частиц разной относительной плотности и размера существуют менее трудоемкие подходы, основанные на иммунологическом связывании молекул на поверхности экзосом. При этом антитела к экзосомальным белкам (маркерам) могут быть фиксированы на поверхности латексных частиц, матрикса спин-колонок или лунок иммунологических планшетов, что определяет возможность выбора оптимальной методики. Методы иммуно-аффинной изоляции экзосом реализованы рядом компаний в виде наборов для быстрого выделения экзосом из различных биологических жидкостей (плазмы, сыворотки, мочи). В основе утверждений об эффективности таких наборов лежит предположение о том, что «таргетные» белки (CD63, CD81, CD9) секретируются на поверхности «всех и только» экзосом, что не совсем верно. Этот фактор в сочетании с фактором относительной дороговизны наборов для иммуно-аффинной изоляции экзосом является основным недостатком метода.
Выделение нано-везикул возможно путем преципитации или агглютинации с помощью полиаффинных полимеров или белков растительного происхождения. Эти соединения неспецифично взаимодействуют с поверхностью многих экзосом и приводят к образованию мультивезикулярных конгломератов, которые осаждаются при «щадящих» режимах центрифугирования. Низкая специфичность такого взаимодействия приводит к ко-преципитации экзосом и различных молекулярных комплексов. В некоторых ситуациях это допустимо. Так, например, выделение экзосом из мочи для последующего анализа экзосомальной микроРНК может быть проведено путем агглютинации экзсом лектинами, т.к. ко-преципитация не экзосомальных протеинов (преимущественно, белка Тамма-Хорсфалла) не влияет на конечный результат.
 
Back to content | Back to main menu