- oncosystem_new

Go to content

Main menu:

ТЕХНОЛОГИИ > Микровезикулы
АНАЛИЗ ФИЗИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ (ВМВ)
Размер экзосом (около 100 нм)  ниже порога чувствительности метода световой микроскопии (300-500 нм). Но несмотря на «наноразмерность», экзосомы могут быть визуализированы методами флуоресцентно-световой, сканирующей или трансмиссионной электронной микроскопии. С помощью флуоресцентных красителей экзосомы могут быть визуализированы в виде светящихся точек, что позволяет локализовать их относительно клеток или клеточных органелл. Электронная микроскопия позволяет исследовать структуру единичных экзосом, с помощью этого метода можно оценить форму, размеры, целостность каждой отдельной везикулы. Методы визуализации экзосом пока имеют значение в рамках  фундаментальных исследований, но не исключено, что в ближайшее время эти методы будут востребованы в клинической практике.
Более отчетливые перспективы диагностического применения могут иметь методы количественного анализа экзосом, которые позволяют в той или иной степени оценить размер, поверхностный заряд, количество, а иногда и качество везикул в составе исследуемого образца. Так, наиболее широкое применение имеют методы измерения размеров микро-везикул, путем анализа корреляционной функции флуктуаций интенсивности света, отраженного взвесью этих частиц в жидкости (корреляционная спектроскопия). При этом размер частиц (точнее, их гидродинамический радиус) из коэффициента их диффузии и показателя вязкости жидкости по формуле Стокса-Эйнштейна. Эта технология (DLS, dynamic light scattering) реализована в ряде приборов отечественного («ЛКС-03», ИНТОКС -Россия) и зарубежного (Zetasizer Nano, Malvern – UK; Nanotrac Wave; Microtrac – USA) производства. Метод позволяет определить среднее значение гидродинамического радиуса частиц в анализируемом объеме жидкости. Точность такого анализа тем выше, чем более однородна по размеру смесь везикул. С меньшей точностью можно оценить относительное распределение частиц по размеру в составе неоднородной смеси, при этом метод позволяет «улавливать» лишь четырехкратную разницу между средним размером популяций (например, 100 нм и 400 нм). Позднее была разработана технология детекции света, отраженного отдельными нано-частицами с помощью цифровой камеры. Анализ серии таких «изображений» одной частицы позволил «отслеживать» ее движение и вычислять размер (NTA, nanoparticles tracking analysis). Эта методика позволяет анализировать взвеси везикул разного размера, оценивать концентрацию везикул и распределение по размеру. При этом «улавливается» разница между частицами с соотношением размеров 1 : 1,33 (например, 300 нм и 400 нм). Эта технология реализована в приборах серии Nanosight, производства компании Malvern – UK.
Методика проточной цитометрии также может быть использована для анализа нано-везикул, и теоретически, она позволяет «детектировать» отдельно каждую экзосому. Но, нижняя граница детектируемых частиц для большинства современных цитометров определяется как 150-200 нм, т.е. размер экзосом находится на грани порога чувствительности метода. Некоторые приборы предполагают возможность калибровки с тем, чтобы игнорировать сигналы от частиц больших размеров и несколько увеличить чувствительности анализа частиц малых размеров. Но более надежным решением проблемы является использования микро-частиц (размером от 1 до 5 мкм), «декорированных» антителами к белкам поверхности экзосом (CD63, CD9, CD81), которые связывают экзосомы, и флуоресцентно-меченых вторичных антител, которые опосредуют количественную оценку связанных экзосом. Такой подход позволяет произвести измерения в надежном диапазоне чувствительности прибора, но непосредственные результаты анализа требуют аккуратной интерпретации. Использование методов иммуно-аффинного связывания основано на предположение, что «все и только» экзосомы несут на поверхности т.н. экзосомальные маркеры. Чем ближе к истине это предположение, чем адекватнее оказываются результаты измерений, проведенных методом проточной цитометрии.
Менее популярна, но не менее перспективна в приложении к экзосомам методика фракционирования частиц в поперечном поле. Метод был разработан и запатентован в  профессором Кельвином Гиддингсом в 1966 году, работавшим в Университете штата Юта (США). Позднее профессором Гиддингсом был создан научно-исследовательский центр по изучению фракционирования частиц в потоке, под его руководством была разработана теория и создано множество методик фракционирования в физических полях различной природы. Основной принцип, по которому происходит разделение наночастиц, реализуется во всех методах, но с применением полей различной физической природы. Поле обычно направлено перпендикулярно параболическому потоку внутри канала. Оно «прижимает» частицы к нижней части канала, противодействуя диффузионным силам, которые стремятся вынести частицы в параболический поток. Наночастицы меньшего размера попадают в поток раньше, чем более крупные частицы, и, следовательно, они появляются на выходе из канала первыми. К настоящему времени опубликовано несколько исследований, в которых была показана возможность воспроизводимого разделения экзосом на несколько десятков или сотен фракций, хотя биологическое значение таких фракций пока не ясно.
 
Back to content | Back to main menu